Diseño, construcción y expresión in vitro de péptidos antimicrobianos recombinantes a partir de cecropina para su aplicación en el control de agentes patógenos en la acuicultura.

CONSULTE EN LINEA A TRAVES DE REPOSITORIO INSTITUCIONAL

Tesis (Doctor en Biotecnología) -- Profs. guías: Sergio Mashall, Gloria Arenas

h. 65 - 82

[Resumen del autor]

En la acuicultura los organismos son cultivados en lugares confinados que alcanzan altas densidades, condición que los hace susceptibles a enfermedades causadas por agentes patógenos donde destacan virus, bacterias y hongos. En este trabajo se buscó aportar una alternativa al uso de antibióticos y vacunas en el combate contra patógenos endémicos de la acuicultura, mediante el diseño y creación de moléculas recombinantes a partir de componentes naturales del sistema inmune innato de invertebrados. Para esto se utilizó el enfoque del ADN recombinante y sistemas de expresión en Escherichia coli. Se diseñaron y construyeron nuevas moléculas doblete del péptido antimicrobiano cecropina A de Drosophila me/anogaster combinando la secuencia codificante del gen CEC A 1 regular (CECdir) con su forma invertida (CECret) con la configuración única de CECdi..-CECret y CECrerCECdir. Estas dos moléculas recombinantes fueron generadas usando una reacción de PCR dirigido por tres primers donde una molécula híbrida con la secuencia codificante de CECdir fue unida en fase con la secuencia codificante de CECret y viceversa. Para obtener estas construcciones se sintetizó químicamente la secuencia codificante para generar un retropéptido de CEC con los mismos aminoácidos de CEC, pero con la polaridad invertida. Ambos péptidos antimicrobianos dobles fueron clonados en vectores de expresión para su posterior recuperación desde E co/i, buscando de esta manera evaluar su eventual actividad antimicrobiana mejorada. Se propuso un mecanismo para rastrear los péptidos antimicrobianos generados con mayor actividad generados mediante una cepa "porosa" E609L utilizando el péptido señal periplasmático pe/B, que liberara el contenido periplasmático al medio que permitiera su monitoreo. Por otro lado se logró expresar el péptido recombinante en células Ecoli BL21 (DE3) sin necesidad de recurrir a un péptido señalo proteína de fusión, integrado en el vector de expresión pET27b+. El péptido fue purificado obteniéndose un rendimiento importante desde cuerpos de inclusión, recuperándose además una actividad aumentada contra una variedad de patógenos comparada con la molécula parental monomérica y su retroforma. Este péptido además resultó tener baja citotoxicidad, como comprobado sobre la línea celular de peces CHSE-214, elemento crucial para su potencial aplicación terapéutica. Se intentó por otro lado por primera vez la expresión mediante el fago lambda CE6 para la expresión de péptidos antimicrobianos, debido al éxito mostrado en expresar otras proteínas extremadamente tóxicas. Adicionalmente ambos péptidos dobles, así como los péptidos parentales fueron clonados y expresados en el vector de expresión pTYB11 en células de Ecoli ER2566, recuperando la actividad antimicrobiana en péptidos solubles mediante el autoclivaje desde una proteína de fusión asociado al splicing de proteínas (inteinas). La actividad obtenida fue equivalente para ambos modelos.

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